取(N+3)組 12 個一組的反應管，按順序第一組 12 管中全部加入 2μL 的 NG-DW，第二組 12管中全部加入 2μL的 NG-Ecoli，第三組 12 管中全部加入 2μL 的樣品 1 模板，第四組 12 管中全部加入 2μL 的樣品 2 模板，…，最后組 12 管中全部加入 2μL 的PG-Ecoli。

蓋好 PCR 管蓋后，渦旋混勻 30s，離心 1min，立即進行 PCR 擴增反應。

3.擴增反應（擴增及產物分析區）

按下列條件設置擴增反應：（如需使用熒光法進行檢測請選擇 FAM 通道）

PCR 循環			熒光收集位點
37℃	10 分鐘	1 個循環	—
95℃	10 分鐘	1 個循環	—
95℃	30 秒	30 個循環	—
63 ℃	30 秒		—
72℃	90 秒		※
72℃	5 分鐘	1 個循環	—

4.產物電泳（擴增及產物分析區）

稱量 4. 0g 瓊脂糖粉，加入至 200 mL 的 1×TAE 電泳緩沖液中，充分混勻。使用微波爐反復加熱至沸騰，直到瓊脂糖粉*融化形成清亮透明的溶液。待瓊脂糖溶液冷卻至 60℃右時，加入溴化乙錠( EB )至終濃度為 0.5μg/mL，充分混勻后，輕輕倒入已放置好梳子的模具中，凝膠長度要大于 10cm，厚度宜為 3mm~5mm。檢查梳齒下或梳齒間有無氣泡，用一次性吸頭小心排掉瓊脂糖凝膠中的氣泡。當瓊脂糖凝膠*凝結硬化后,輕輕拔出梳子，小心將膠塊和膠床放入電泳槽中，樣品孔放置在陰。向電泳槽中加入 1×TAE 電泳緩沖液，液面高于膠面 1mm~2mm。將5μL PCR 產物與 1μL 6×上樣緩沖液混勻后，用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下膠孔，小心上樣于孔中；陽性對照的 PCR 反應產物加入到最后一個泳道;第一個泳道中加入 2 μ L 分子量 Marker 。接通電泳儀電源，根據公式：電壓=電泳槽正負極間的距離（cm）×5V/cm 計算并設定電泳儀電壓數值；啟動電壓開關，電泳開始以正負極鉑金絲出現氣泡為準。電泳 30min~45min 后，切斷電源。取出凝膠放入凝膠成像儀中觀察結果，拍照并記錄數據。

u 可使用 Gold view、Gal-Rad 等等效的核酸熒光染料替代 EB。

u 推薦使用 DNA Marker：DL2000 或 100bp ladder，等可指示 100bp~1500bp 條帶的 Marker。

◆ 結果分析

1.陰陽性判讀：

進行電泳檢測時，需對比 Marker 進行判斷，當目的靶標對應位置出現單一顯著條帶時可判斷該靶標為陽性；否則為該靶標檢測為陰性。（使用熒光定量 PCR 儀檢測時，檢測孔Ct≤30 時判斷該孔為陽性；當檢測孔Ct＞30 時，該檢測孔為陰性）

示例電泳圖

2.有效性判讀：

需同時滿足：1.空白對照中所有泳道均為陰性；2.陰性對照中 uidA 泳道陽性，其余泳道陰性；2.陽性對照中所有泳道陽性，此時可判斷實驗有效。如無法滿足上述條件，則實驗無效，需重復實驗；如重復后結果仍為無效，請于本公司技術支持聯系。

3.結果判讀：

在實驗有效的情況下，可根據下表進行判讀：

致瀉大腸埃希氏菌類別	目標條帶的種類組合
EIEC	ipaH（＋）	uidA （＋／－）
EAEC	aggR，astA，pic 中一條或一條以上陽性
EPEC	bfpB（＋／－），eae（＋），stx1（－）stx2，（－）
STEC/EHEC	stx1，stx2 中一條或一條以上陽性，eae（＋／－），bfpB（－）
ETEC	lt，stp，sth 中一條或以上陽性

u 97%以上大腸埃希氏菌為 uidA 陽性，可參考陰性對照中該基因檢測結果判斷擴增效果；

u 當結果判定為EPEC 陽性時，若 bfpB 靶標為陽性則說明樣品含有典型EPEC；若 bfpB 靶標為陰性則說明樣品為非典型EPEC；

當結果判定為STEC/EHEC 陽性時，若 eae 靶標為陽性則說明樣品含有典型EHEC；若 eae 靶標為陰性則說明樣品為非典型EHEC。

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